YRD. DOÇ. GÜLNUR ARABACI

Kiwano (Cucumis metuliferus) bitkisinde peroksidaz enzimlerinin kinetik özelliklerinin incelenmesi Kinetic properties of some peroxidases from kiwano (Cucumis metuliferus)

Bu çalışmada, Cucumis metuliferus (kiwano) bitkisinden elde edilen Peroksidaz (POD) ve Askorbat peroksidaz (APX) enzimlerinin kinetik özellikleri incelenmiştir. POD üçlü-faz ayırma tekniği (TPP) ve diyaliz işlemleri ile kısmen saflaştırılmıştır. SDS-PAGE ve Native PAGE yöntemleriyle saflık kontrolü yapılmıştır. Ham enzim kullanılan karakterizasyon çalışmalarında 4-metil katekol, ABTS, guaiakol, kafeik asit, o-dianisidin, o-fenilen diamin, progallol, katekol, gallik asit ve H?O? substratları kullanılmıştır. Her bir substrat için Michaelis-Menten sabiti (KM) ve maksimum reaksiyon hızı (Vmax) hesaplanmıştır. Kafeik asit en yüksek substrat spesifikliğine sahiptir. Enziminin optimum pH?sı 4,0?7,5 arasında ve optimum sıcaklığı ise 30 ? 40 ? arasında bulunmuştur. Kiwano POD enzimini NaN3, tiyoüre, KCN, L-Sistein, EDTA, SDS, Triton X-100 ve L-Glutatyon, Zn+2, Mg+2, Fe+2, Pb+2, Sn+2 metalleri, metanol, DMSO, aseton, etanol, 1-bütanol, 2-propanol, kloroform ve etil asetat organik çözücüleri inhibe etmektedir. Pek çok POD enzimini 2- merkapto etanol inhibe ederken kiwano POD enzimini inhibe etmemiştir. Bazı aminoasitlerin POD enzimi üzerine etkisi incelendiğinde L-histidin en yüksek aktivasyona, L-prolin en yüksek inhibisyona sebep olmuştur. POD optimum iyonik şiddeti NaCl? ün 4 mM konsantrasyonunda çıkmıştır. Yapılan POD depolama kararlılığı sonucuna göre; oda sıcaklığında dört yüz saat sonrasında enzim aktivitesi %84, +4 oC? de altmış günün sonrasında 83%, -20 oC? de yüz otuz beş gün sonrasında % 73 oranında azalmıştır. Kiwano askorbat peroksidaz (APX) enziminin maksimum aktivite gösterdiği optimum pH ve sıcaklık değerleri sırasıyla 6,2 ve 30 oC olarak bulunmuştur. Kiwano APX enzim kinetiğinden elde edilen sonuçlara göre; KM ve Vmax değerleri sırasıyla askorbik asit için 284.80 µM, 0.0035 EÜ/dk. H2O2 için 64.90 µM, 0,0077 EÜ/dk. olarak bulunmuştur. Kiwano APX üzerine NaN3, KCN, 2-merkapto etanol, L-sistein, EDTA, iyodoacetamid, 2-nitrobenzoik asit ve L-glutatyon?nun inhibisyon etkisi incelendiğinde L-Glutatyon ve EDTA hariç hepsinin inhibisyon etkiye sahip olduğu bulunmuştur. Metal iyonlarının APX aktivitesi üzerine etkisi sonucuna göre Fe+2, Cu+2, Ba+2 metallerinin bazı konsantrasyonlarında aktivasyona sebep olurken, diğer metaller inhibisyona sebep olmuştur. APX enzimi üzerine amino asit etkisi çalışmasında; L-prolin en iyi aktivatör olarak, L-glutamik asit ise en etkili inhibitör olarak görev yapmaktadır. Anahtar kelimeler: Peroksidaz /askorbat peroksidaz, kiwano, Cucumis metuliferus, NATİVE / SDS-PAGE, üçlü-faz ayırma tekniği (TPP).