PROF. DR. ŞEVKET ARIKAN

Oleik ve linoleik asidin in vitro sığır embriyo gelişimi ve kalitesine etkileri The effects of oleic and linoleic acid on development and quality of in vitro bovine embryos

Bu çalışma, doymamış yağ asitlerinden oleik asit (18:1 cis-9- oktadekadienoik asit) ve linoleik asidin (18:2 (n?6), 9,12- oktadekadienoik asit) sığır embriyolarının in vitro gelişimi üzerine etkilerini araştırmak amacıyla gerçekleştirildi. Çalışmada kullanılan ovaryumlar, Ankara iline bağlı Çubuk ilçe mezbahasından temin edildi. Toplanan 198 adet ovaryumdan aspirasyon yöntemiyle, 1304 adet oosit elde edildi. Ancak bu oositlerden A ve B kalitede olduğuna karar verilen 1124 adedi çalışmada kullanıldı. Maturasyon, kapasitasyon, fertilizasyon ve embriyo kültürü işlemleri %5 CO2 ve %95 nem içeren 38,5 oC’lik inkübatör ortamında gerçekleştirildi. Maturasyon medyumu olarak doku kültür medyumu 199 (TCM-199) kullanıldı. Bu medyumdan 100 µL’lik maturasyon mikrodamlaları hazırlandı. Damlaların üzeri mineral yağ ile kapatıldı. Her mikrodamlaya ortalama 18’er adet oosit yerleştirildi. Oositler, maturasyon amacıyla 22 saat süreyle inkübe edildi. Kumulus ekspansiyonu görülen oositler mature kabul edildi. Spermatozoonların kapasitasyonu amacıyla heparin (5 U/mL) ve kafein (2 mM) içeren Brackett ve Oliphant (BO) medyumu kullanıldı. Spermatozoonlar 25000/oosit olacak şekilde doze edildi. Oosit ve spermatozoonlar fertilizasyon amacıyla 6 saat inkübe edildi. Ardından Charles Rosecrans (CR1aa) embriyo kültür medyumu ile yıkanan oositler, oleik asit (10 µM, 100 µM ve 1000 µM) ve linoleik asit (10 µM, 100 µM ve 1000 µM) içeren CR1aa medyumunda inkübasyona kaldırıldı. İnkübasyonun 48. saatinde ilk bölünme kontrolü yapıldı. Fertilizasyonu takip eden 168. saatte ise morula-blastosist aşamasına gelen embriyolar tespit edildi. Verilerin istatistiksel analizi khi-kare yöntemiyle yapıldı. Zigotun bölünme oranları; kontrol grubu için %53,64, linoleik asit için %62,59 (10 µM), %50,00 (100 µM) ve %58,55 (1000 µM), oleik asit için ise %62,25 (10 µM), %64,29 (100 µM) ve %71,70 (1000 µM) olarak bulundu. Gruplar arasında yapılan karşılaştırmada, 1000 µM oleik asidin diğer deneme gruplarına göre daha etkili olduğu görüldü (p<0,01). Bölünme oranları ortalaması ise linoleik asitte %57,11, oleik asitte %66,16 olarak bulundu. Zigotun morula-blastosist evresine ulaşma oranları, kontrol grubunda %13,25, linoleik asit için %23,13 (10 µM), %11,81 (100 µM) ve %21,05 (1000 µM), oleik asit için ise %25,17 (10 µM), %28,57 (100 µM) ve %34,59 (1000 µM) olarak bulundu. Morula-blastosist evresine ulaşma ortalaması ise linoleik asitte %18.74, oleik asitte %29,53 olarak hesaplandı. Sonuç olarak, Oleik asitin her üç dozunun zigotun bölünme oranını ve ortalamalarını, morula-blastosist evresine ulaşma oranını ve ortalamalarını arttırdığı ve in vitro embriyo kültüründe antioksidan olarak kullanılabileceği kanısına varıldı. Oleik asidin 1000 µM'lik dozunun en iyi sonucu verdiği görülmüştür. Linoleik asit ile yapılan karşılaştırmalarda oleik asidin anılan parametreler yönünden daha etkili olduğu saptandı.

Sağlıklı Ankara Keçilerinin hematolojik ve biyokimyasal parametrelerinin değerlendirilmesi

Sağlıklı hayvanlara ait kan değerlerinin elde edilmesi, klinisyenlere hastalıkların teşhis ve tedavisinde yardımcı olmaktadır. Hematolojik ve biyokimyasal parametreler üzerine ırk, yaş ve cinsiyetin etkisi bulunmaktadır. Irka ait kan değerlerinin referans aralıklarının tespit edilmesi bu değerlerin değişim aralıklarının saptanması açısından önem arzetmektedir. Yapılan çalışmada sağlıklı Ankara keçilerinin hematolojik ve biyokimyasal parametrelerine ait referans aralıklarının yaş ve cinsiyete göre belirlenmesi amaçlandı. Çalışmada, klinik olarak sağlıklı oldukları belirlenen 102 ergin (1-3 yaş, 52 erkek, 50 dişi) ve 98 genç (3-6 aylık, 48 erkek, 50 dişi) olmak üzere farklı yaş ve cinsiyette toplam 200 adet Ankara Keçisi kullanıldı. Ankara keçilerinden alınan kan örneklerinde; akyuvar (WBC) ve alyuvar sayımı (RBC) yapıldı, nötrofil, lenfosit, monosit, eozonofil, bazofil yüzdeleri ile hemoglobin (Hb) ve hematokrit değerleri belirlendi. Ayrıca, Ortalama alyuvar hacmi (MCV), ortalama alyuvar hemoglobini (MCH) ve ortalama alyuvar hemoglobin derişimleri (MCHC) hesaplandı. Hazırlanan kan serumlarında ise total kolesterol, total bilirubin, trigliserit, düşük dansiteli lipoprotein (LDL-kolesterol), yüksek dansiteli liprotein (HDL-kolesterol), kreatinin, kan üre nitrojen (BUN), total protein, albumin, globulin, glikoz, üre, kreatin kinaz (CK), gama glutamil transpeptidaz (GGT), laktat dehidrogenaz (LDH), alanin aminotransferaz (ALT), aspartat aminotransferaz (AST) aktiviteleri, potasyum (K), sodyum (Na), kalsiyum (Ca), inorganik fosfor (Pi), magnezyum (Mg), demir (Fe) düzeyleri belirlendi. Eritrosit, nötrofil, Hb, MCH değerleri incelendiğinde genç Ankara keçileri arasında cinsiyete bağlı bir fark olmadığı, ancak bu parametrelere ait değerlerin ergin dişi keçilerde ergin erkek keçilere oranla daha yüksek olduğu bulundu. Hematokrit değer, MCV ve MCHC değerlerinde ergin dişi keçilerin diğer tüm keçilere oranla yüksek değere sahip olduğu tespit edildi. Keçi lenfosit değerleri arasında yaşa ve cinsiyete bağlı fark olmadığı belirlendi. Monosit, WBC ve bazofil değerleri ile cinsiyet arasında bir ilişki olmadığı, her iki cinsiyette de monosit ve WBC değerlerinde yaşa bağlı bir azalma gözlenirken eozonofil değerlerinde artış tespit edildi. Serum total protein, kreatinin, total kolesterol, HDL kolesterol düzeyleri ve GGT aktivitesinde dişi keçiler arasında yaşa bağlı anlamlı bir fark olmadığı, ancak bu parametrelerin genç erkek keçilerde diğer keçilerden daha yüksek olduğu belirlendi. Ergin keçilerin daha yüksek serum glikoz değerine sahip olduğu bulundu. Serum albumin düzeyinin yaştan etkilenmediği ancak, erkeklerin dişilere kıyasla daha yüksek albümin değerine sahip olduğu belirlendi. Genç erkek keçilerin LDH aktivitesi, globülin, K ve Mg değerleri diğer keçilerin değerlerinden daha yüksek olduğu tespit edildi. Erkek keçilerin trigliserit değerinin dişilerden yüksek olduğu bulundu. Ergin dişi keçilerin genç dişi keçilere oranla daha yüksek Fe düzeyine sahip olduğu belirlendi. Sodyum değerinin cinsiyetten etkilenmediği ancak ergin keçilerin genç keçilere oranla daha yüksek Na değerine sahip olduğu tespit edildi. Sonuç olarak, sağlıklı Ankara keçilerinin hematolojik ve biyokimyasal parametrelerinin bazılarının yaş ve cinsiyetten etkilenirken, bazılarının etkilenmediği belirlendi. Bu çalışma sonuçlarının, klinik uygulama yapan veteriner hekimlerin kullanımı için, sağlıklı Ankara keçilerine ait hematolojik ve biyokimyasal parametreleri değişim sınırlarını gösteren bir kaynak olma niteliği taşıyabileceği kanısına varıldı.

Kedi granüloza hücre kültüründe, FSH ve LH hormonlarının steroidojenik aktivite üzerine etkilerinin araştırılması Effects of FSH and LH on steroidogenic activity in cat granulosa cells

Bu çalışmada, kedi granüloza hücre kültüründe, 22(R)-hidroksikolesterol (22R-HC), folikül uyarıcı hormon (FSH) ve lüteinleştirici hormon (LH)`un progesteron ve östradiol sentezi üzerine etkileri araştırıldı. Çalışmada toplam 18 adet dişi kedi kullanıldı. Kediler altışarlı 3 gruba ayrıldı. Birinci gruptaki kedilerden elde edilen granuloza hücreleri, bazal progesteron ve östradiol düzeylerinin belirlenmesi ile kolesterolün (10 ng/ml) progesteron ve östradiol sentezi üzerine etkisinin incelenmesinde kullanıldı. İkinci gruptaki kediler, FSH (10 ve 100 ng/ml) ile FSH ve kolesterolün (10 ng/ml) kombine kullanımının; üçüncü gruptaki kediler ise, LH (10 ve 100 ng/ml) ile LH ve kolesterolün kombine uygulanmasının bazal progesteron ve östradiol sentezi üzerine etkisinin incelenmesinde kullanıldı. PMSG hormon uygulamasını takiben 5. günde kedilerden ovariohisterektomi operasyonu ile ovaryumlar alınarak steril şartlar altında laboratuara getirildi. Laminar flow içerisinde foliküller ikiye ayrılıp, granüloza hücreleri folikül duvarından toplandıktan sonra % 5 fetal calf serum (FCS) ile kaplanmış 24 kuyucuklu pleytte 5 gün süre ile inkübe edildi. Kültür mediumu olarak, 10-7M androstenedione, % 0.1 ITS ve % 0.1 bovine serum albumin içeren Dulbecco’s Modified Eagle’s mediumu (DMEM) / HAM F-12 kullanıldı. Kültürün 1. ve 3. günlerinde hücrelere 22R-HC (10 ng/ml), FSH (10 ve 100 ng/ml), LH (10 ve 100 ng/ml), FSH (10 ng/ml) + LH (10 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + FSH (10 ve 100 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + LH (10 ve 100 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + FSH (10 ng/ml) + LH (10 ng/ml) uygulamaları yapıldı. Üçüncü ve beşinci günlerde ise uygulamaların yapıldığı kuyucuklardaki mediumlar toplanarak, hücrelerin sentezledikleri progesteron ve östradiol düzeyleri ölçüldü. Kolesterolün uygulandığı gruplarda, progesteron sentezinde kültürün 3. ve 5. günlerinde, östradiol sentezinde ise sadece kültürün 5. gününde önemli bir artış gözlendi (p<0.001). Kolesterol uygulanan gruplarda bazal progesteron miktarında kültürün 3. gününde 9.1 kat ve 5. gününde ise 13.5 kat artış belirlendi. Bazal östradiol miktarında ise kültürün 3. gününde önemli bir artış bulunmamasına rağmen, 5. gününde 4.7 kat artış tespit edildi. Folikül uyarıcı hormonun her iki dozunda da progesteron sentezinde önemli bir fark bulunmamasına rağmen östradiol miktarındaki fark önemli bulundu (p0.05). Östradiol miktarında ise sadece LH`ın yüksek doz (100 ng/ml) uygulandığı gruplarda kültürün 5. gününde, meydana gelen artış önemli bulundu (p<0.05). Kültürde FSH ve LH`ın 22R-HC ile kombine kullanımının hem östradiol hem de progesteron miktarını önemli miktarda arttırdığı tespit edildi (p<0.001). Kültür sonunda, granüloza hücreleri 3ß-hydroxysteroid dehydrogenase (3ß?HSD) aktivitesi yönünden boyandı. Boyama sonucunda yüksek doz (100 ng/ml) FSH`ın 22R-HC (10 ng/ml) ile kombine uygulandığı grupta 3ß?HSD enzim aktivitesinin daha yüksek olduğu gözlendi. Sonuç olarak mevcut çalışma ile kedilere özel bir granüloza hücre kültürü protokolü geliştirildi. Bu protokolün, kedi granüloza hücre stereoidogenezisi üzerine daha detaylı çalışmaların yapılmasına ve folikül içerisindeki etkin mekanizmaların ortaya konulmasına olanak sağlayabileceği düşünülmektedir.