PROF. DR. SEMRA KOCABIYIK

Expression profiling of Thermoplasma volcanium GSS1 under stress conditions with specific emphasis on proteasome associated regulatory VAT genes Thermoplasma volcanium GSS1’in stres koşulları altında proteazoma ilişkin düzenleyici VAT genleri ağırlıklı olmak üzere gen anlatım profilinin belirlenmesi

Thermoplasma volcanium (Tpv) GSS1in dış stres etkenleri olan; pH, ısı-şoku ve hidrojen peroksit ile tetiklendiğinde proteasoma ilişkin iki VAT geninin anlatımında oluşan farklılıklar nicel RT-PCR ve Western aktarım ve hibritleme teknikleri ile incelenmiştir. Ayrıca genom boyutunda mikrodizinler aracılığı ile Tpvnin çevresel streslere tepkisinin geniş kapsamlı transkriptom düzeyinde analizi yapılmıştır. Nicel RT-PCR analizleri göstermiştir ki, VAT genleri ısı şoku (65ºC ve 70ºC), pH stresi (pH 4.0) ve oksidatif strese (0.02 mM H2O2) 120 dakika boyunca maruz bırakıldıklarında özgün stres yanıtı oluşturmuşlardır. Western hibritleme qRT-PCR sonuçlarını doğrulamıştır. Bu sonuçlar Tpv hücrelerinde VAT proteininin muhtemelen proteasomla birlikte çevresel strese özellikle ısı-şokuna uyumda, kritik bir role sahip olduğunu göstermektedir. Mikroarray analizi sonuçları Tpv hücrelerinde genlerin strese maruz kaldıkları 60 dakika boyunca çoğunlukla anlatımlarının düştüğünü ortaya çıkartmıştır. Bu grup genler içinde işlevsel olarak enerji üretimi ve dönüşümü, transkripsiyon ve translasyon ile bağlantılı olanlar geniş kapsamlı ve önemli ölçüde inhibe olmuşlardır. Isı-şoku yanıtı, ısı-şoku bağlantılı genlerin (örneğin, GrpE) anlatımının artması ile ilişkilendirilebilirken, pH ve oksidatif strese yanıt membran ve transport ile bağlantılı genlerin anlatımının artması ile karakterize edilmişlerdir. Strese tepki gösteren genler arasından seçilen şeker permeaz ve GrpE genleri mikrodizin verisini doğrulamak için qRT-PCR ile analiz edilmişlerdir. Bu sonuçlar seçilen genlerin her iki teknikle belirlenen anlatım örüntülerinin tutarlı olduğunu göstermiştir. Toplu olarak bu sonuçlar öneriyor ki, tüm stres koşullarında hata eğilimli protein sentezini önlemek ve enerji gerektiren sentetik süreçlerden kaçınmak için transkripsiyon ve translasyonun engellenmektedir. Tüm stres koşullarında enerji dengesinin sürdürülebilirliği karbonhidrat taşıma ve metabolizmasının aktivasyonu ile sağlanmıştır. Tpv ayrıca stresten korunma mekanizmasının bir parçası olarak strese özgü genleri de (ör, GrpE-Isı-şoku, redoksinler-Oksidatif stres, Taşıyıcılar-pH stres) düzenlemektedir.

The role of small heat shock proteins of the thermoacidophilic archaeon, Thermoplasma volcanium in the stress response Thermoasidofilik bir arkea olan Thermoplasma volcanium?un küçük ısı şoku proteinlerinin stres tepkisindeki rolü

Bu çalışmada termoasidofilik bir arkea olan, Thermoplasma volcanium’dan elde edilen küçük ısı şoku proteinlerinin stres tepkisindeki rolleri araştırılmıştır. Elde ettiğimiz sonuçlar, E.coli’ de heterolog olarak yüksek düzeyde anlatımı yapılan TVN0775 geninin bu bakterinin 53°C’ de, iki saat boyunca sıcaklığa dayanıklılığını arttırdığını göstermiştir. Ancak Tp. volcanium’ un ikinci küçük ısı şoku proteinini kodlayan TVN0984 geni, mezofilik bakteri (E.coli) nin ısıya dayanıklılığını arttırmada etkili olmamıştır. TVN0775 ve TVN0984 gen anlatımlarının, 65°C’ de ısı şokundan sonra 3 kat arttığı, Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) ile gösterilmiştir. Her iki genin de anlatımı 70°C’ de uyarılırken, TVN0984 geninin anlatımındaki artış (yaklaşık 5 kat), TVN0775 (yaklaşık 1,5 kat), geninden daha fazla olmuştur. Tp. volcanium hücreleri yüksek pH’ya (pH: 3.5, pH: 4.0, pH: 4.5, pH: 5.0) maruz bırakılmışlar ve küçük ısı şoku proteinlerinin gen anlatımındaki değişim profilleri incelenmiştir. Sonuçlar TVN0775 gen anlatımının, yüksek pH derecesine, TVN0984 gen anlatımından daha duyarlı olduğunu göstermiştir. TVN0775 gen transkripsiyonu, pH: 4.0′ te en fazla 2.5 kat uyarılmış ve daha yüksek pH değerlerinde (pH: 4.5 ve pH: 5.0) ise ya azalmış ya da değişmemiştir. Diğer yandan, TVN0984 gen anlatımı pH: 4.0’te değişmemiş ancak daha yüksek pH değerlerinde önemli ölçüde azalmıştır. Oksidatif stresin TVN0775 ve TVN0984 genlerinin anlatımına etkisi, Tp. volcanium hücrelerine, 0.01 mM, 0.02 mM, 0,03 mM ve 0.05 mM H2O2 uygulanarak incelenmiştir. Düşük H2O2 derişimlerinde (0.01 mM ve 0.02 mM), her iki küçük ısı şoku protein geninin de transkripsiyonu uyarılmıştır. Daha yüksek H2O2 derişimlerinde ise her iki genin transkripsiyonu da ya değişmemiş ya da azalmıştır. Bu çalışmada son olarak, rekombinant TVN0775/sHsp’ni, N-ucundaki 6X Histidin-etiketi taşıyan bir füzyon proteini olarak Ni-NTA afinite kolon ile homojen olarak saflaştırılmıştır. Saflaştırılmış protein örnekleri, substrat olarak sığırdan elde edilen glutamat dehidrojenaz enziminin kullanıldığı şaperon aktivite deneylerinde kullanılmıştır. Tp. volcanium kaynaklı küçük ısı şoku protein varlığında 45°C, 50°C ve 53°C’ lerde, glutamat dehidrojenaz enzimin aktivitesini yeniden kazanımının; kendiliğinden katlanmadaki kazanımına göre daha fazla olduğu görülmüştür. TVN0775 küçük ısı şoku proteini, 30 dakika süresince 2.5 M derişimindeki GdnHCl ile denatürlenmiş boGDH enziminin aktivitesinin yeniden kazanımını da arttırmıştır.