PROF. DR. PINAR ÇALIK

Effects of CO-carbon sources in recombinant human erythropoietin production by pichia pastoris Pichia pastoris ile rekombinant insan eritropoietin uretiminde ikinci karbon kaynaklarının etkileri

Bu yüksek lisans tezinde, farklı ikinci karbon kaynaklarının değişik üretim stratejileri kullanılarak, Pichia pastoris ile terapatik proteinlerden glikoprotein yapısındaki rekombinant insan eritropoietin (rHuEPO) üretimi üzerine etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Proses süresince hücre, sorbitol, mannitol, metanol, rHuEPO, AOX, proteaz ve yan ürünler olan organic asit derişimleri ölçülerek izlenmiştir. Belirtilen amaç doğrultusunda ilk olarak, mannitol ve sorbitolün ikinci karbon kaynağı olarak etkileri P. pastoris Mut+ suşu kullanılarak laboratuvar ölçekli biyoreaktörlerde incelenmiştir. Kullanılan farklı başlangıç konsantrasyonları arasından, 50 g L-1 ikinci karbon kaynağı konsantrasyonun hücre derişimi ve rekombinant protein üretimi için daha ekonomik ve uygun olduğu saptanmıştır. Sonraki aşamada, altı çeşit biyoreaktör işletim stratejisi tasarlanmıştır. Tasarlanan ilk stratejide (SSM) kesikli işletimle 50 g L-1 sorbitol, üretim fazına geçiş anı t=0 st?te beslenmiş ve ardından proses boyunca yarı-kesikli işletimle önceden belirlenen özgül çoğalma hızı µM0=0.03 st-1 olacak şekilde metanol beslemesiyle eşzamanlı olarak, üretim fazının t=0-15 st arasında biyoreaktördeki sorbitol derişimi 50 g L-1 değerinde, özgül çoğalma hızı µSrb0=0.025 st-1 olacak şekilde yarı-kesikli beslemeyle sabit tutulmuştur. Bunu takip eden biyoreaktör deneylerinde ikinci karbon kaynağı olan mannitol kullanılmış, her birinde metanolde özgül çoğalma hızı µM0=0.03 st-1 olacak şekilde yarı-kesikli beslenmiştir. Uygulanan ikinci stratejide, (MM) yalnızca üretim fazına geçiş anı t=0 st?te 40 g L-1 mannitol eklenmiştir. Tasarlanan üçüncü stratejide (MMM), üretim fazı başında 50 g L-1 mannitolün ortama eklenmesinden sonra üretim fazında, ilk tasarlanan strateji (SSM) ile aynı hücre konsantrasyonuna gelene kadar, t=0-9 st arasında, özgül çoğalma hızı µMan0=0.11 st-1 olacak şekilde mannitol konsantrasyonu 50 g L-1 de sabit tutulmuştur. Dördüncü stratejide (MLM), limit miktar olan 3 g L-1 mannitol, üretim fazına geçiş anında kesikli olarak eklenmiş, devamında üretim süresince t=0-10 st arasında özgül çoğalma hızı µMan0=0.005 st-1 olacak şekilde mannitol konsantrasyonu 3 g L-1 de sabit tutulmuştur. Tasarlanan bu stratejilerden sonra, birden fazla kesikli mannitol eklemelerinin yapıldığı yeni besleme stratejileri geliştirilmiştir. Tasarlanan beşinci stratejide (MPM), üretim fazının t=0, 6 ve 12 st de 50 g L-1 mannitol kesikli olarak eklenmiştir. En son tasarlanan stratejide (MPMG) ise, t=0, 7, 14, ve 24 st?de dört defa kesikli olarak, 50 g L-1 mannitol ile fermentasyon ortamında 8 g L-1 olacak şekilde gliserol beslenmiştir. En yüksek rekombinant protein derişimine 645 mg L-1 olarak beşinci stratejinin (MPM) t=9 st?te elde edilirken, en yüksek hücre derişimi olan 109 g L-1 ye ilk strateji (SSM) ile t=48 st de ulaşılmıştır. En yüksek üretimin elde edildiği üretim koşulunda, toplam substrat üzerinden elde edilen en yüksek hücre ve ürün verimleri, sırasıyla YX/St=0.22 g g-1 ve YP/St=2.23 mg g-1 olarak bulunmuştur. Anahtar Kelimeler: Rekombinant insan eritropoetini, Pichia pastoris, karbon kaynakları, besleme stratejileri

Effect of pH on erythropoietin production by recombinant Pichia pastoris in fed-batch operation Rekombinant Pichia pastoris ile eritropoietin üretiminde pH etkisinin yarı kesikli işletim ile araştırılması

Bu çalışmada, pH’ın Pichia pastoris ile rekombinant insan eritropoetini (rHuEPO) üretimi üzerine etkisi pH=4.0, 4.5, 5.0, 5.5 ve 6.0 işletim koşullarında araştırılmıştır. rHuEPO üretimi yarı-kesikli metanol indüksiyonuyla başlatılmıştır. En yüksek hücre derişimi pH=4.5′ de 81.4 g L-1 olarak elde edilmiştir. İkinci karbon kaynağı olan sorbitol kesikli olarak biyoreaktöre eklenmiştir, pH=4.0, 4.5 ve 5.0’de yapılan işletimlerde sorbitol t=15 st’te tükenmiştir. Ancak pH=5.0’in üzerindeki işletimlerde sorbitol tüketim hızının artan pH ile azaldığı gözlemlenmiştir. Elde edilen en yüksek rHuEPO derişimi 0.158 g L-1 olarak pH=4.5’te elde edilmiştir. Elde edilen bu değer pH=4.0, 5.0, 5.5 ve 6.0 da elde edilen derişimlerden sırasıyla 1.43-, 1.24-, 1.95- and 1.23-kat daha yüksektir. Ayrıca pH=4.5’te substrate üzerinden hücre ve rHuEPO verim katsayıları sırasıyla 0.521 g g-1 ve 1.45 mg g-1 olarak bulunmuştur. rHuEPO derişimlerinde işletimlerin son fazlarında proteoliz nedeniyle düşme göstermiştir. Araştırılan pH aralığı asitik olduğundan, ortamdaki asitik proteazların nötral ve bazik proteazlardan daha fazla olduğu bulunmuştur. Buna ek olarak toplam proteaz derişiminin zamanla doğrusal olarak arttığı ve farklı pH’larda yakın değerlere ulaştığı gözlemlenmiştir. Bu nedenle üretim ortamı pH’ı hücre dışı proteaz aktivitesi üzerinde belirgin bir etkiye sahip değildir. Alkol oksidaz (AOX) aktiviteleri farklı pH’larda benzer davranışlar göstermiştir. Elde edilen en yüksek spesifik AOX aktivitesi 110.1 U g-1 CDW olup, en yüksek rHuEPO derişiminin elde edildiği pH olan pH=4.5 de elde edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Rekombinant insan eritropoetini, Pichia pastoris, pH optimizasyonu, alkol oksidaz aktivitesi

Investigation of thermostable recombinant glucose isomerase production by sucrose utilizing Escherichia coli Sukroz tüketebilen Escherichia coli ile ısıya dayanıklı rekombinant glukoz izomeraz üretiminin araştırılması

Bu yüksek lisans tezinin amacı, tasarlanan melas temelli üretim ortamında, metabolik olarak değiştirilmiş sukroz kullanan Escherichia coli ile termostabil glukoz izomeraz (GI: EC 5.3.1.5) üretiminin ara?tırılmasıdır. Deneyler süresince pilot ölçekli biyoreaktörde hücre çoğalması, sukroz tüketimi, rekombinant GI aktivitesi ve yan ürün konsantrasyonları analiz edilmi?tir. Bu amaçla, tez çalışmasının birinci bölümünde, Thermus thermophilus (xylA)un termostabil GIyı kodlayan geni ta?ıyan pRSETA izole edilmi? ve izole edilen pRSETA::xylA plazmitinin E. coli W hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Daha sonra farklı karbon kaynaklarının kullanılarak, en fazla GI enzimi üreten su? seçilmiştir ve seçilen suş E. coli W-26 olarak adlandırılmı?tır. ikinci bölümde, laboratuvar ölçekli çalkalamalı biyoreaktör ve pilot ölçekli biyoreaktör deneyleri ile rekombinant glukoz izomeraz üretimi iki ardışık programla araştırılmı?tır. E. coli W-26, rekombinant GI üretim potansiyeli, üç karbon kaynağı, glukoz, sukroz ve melas ile değişik konsantrasyonlarda araştırılmıştır. Karbon kaynakları ve derişimlerinin etkisi, laboratuvar ölçekli çalkalamalı biyoreaktör deney programında ara?tırılmı?, kalma süresine kar?ı hücre deri?imleri ve GI enzim aktiviteleri ölçülmüştür. 32 g L-1 melas içeren ortamda, glukoz ve sukroz içeren ortamlardan daha yüksek hücre deri?imi ve GI aktivitesi elde edildiğinden başlangıç karbon kaynağı konsantrasyonu olarak kullanılmasına karar verilmi?tir. Bu sonuçlara dayanarak, kompleks melas substratının karbon ve azot kaynağı olarak davrandığı dört set pilot ölçekli yarı-kesikli biyoreaktör deneyi tasarlanmı?tır. Bu kapsamda puls eklemeli ya da eksponansiyel besleme stratejileri kullanılarak dört besleme stratejisi tasarlanmı?; hücre çoğalması, GI üretimi ve yan ürün olu?umları üzerindeki etkileri önceden belirlenmi? aynı özgül çoğalma hızı, ?=0.05 st-1 ile ara?tırılmı?tır. En yüksek hücre deri?imi, t=26 st?te 18.4 g L-1 ve en yüksek rekombinant GI aktivitesi, t=16 st?te 35264.5 U L-1 olarak BR4 koşulunda; 5. ve 8. saatlerde (NH4)2HPO4 ilavesi ile birlikte verilen iki melas eklemesinin ardından 11. saatten sonra yarı-kesikli işletim ile =0.05 st-1 özgül çoğalma hızı kullanılarak hesaplanan eksponansiyel besleme debisi ile melas çözeltisi sürekli beslenerek elde edilmiştir.

Bioprocess development for thermostable glucose isomerase production Isıya dayanıklı glukoz izomeraz üretimi için biyoproses geliştirilmesi

Bu çalışmada, glukoz izomeraz (GI) üretimi için proses geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, öncelikle, ısıya dayanıklı xyl genleri, PCR ile Thermus thermophilus ve Pyrococcus furiosus hücrelerinden çoğaltılarak alınmış ve sırasıyla E.coli BL21 (DE3) ve P.pastoris suşlarına entegre edilmiştir. Fakat, doğal suşlara oranla önemli rekombinant GI aktivitesi artışı sadece rekombinant E.coli suşunda belirlenmiştir. Bu sebeple bu suş sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere seçilmiştir. Daha sonra, doğal ve yapay indükleyicilerin rGI üzerindeki etkisi LacUV5 promoter kontrolu altında laboratuar ölçekli reaktörlerde incelenmiştir. Laktozun, operon indükleyici olarak uzun süreli üretimler için daha verimli olduğu bulunmuştur. rGI üretim miktarının artırılması, E.coli BL21 (DE3) pLysS pRSETA::xylT için yüksek hücre konsantrasyonları elde edilmesi ve ayrıca asetat birikiminin önlenilmesi için karbon kaynağı üstel besleme stratejisine uygun olarak ortama verilmiştir. Üstel besleme stratejisiyle ısıya dayanıklı rGI üretiminde, hücre ve rekombinant E.coli BL21 (DE3) pLysS tarafından asetat oluşumu; dört set yarı kesikli biyoreaktör deneyile, deney öncesi belirlenmiş üç farklı özgün büyüme hızı , 0.1 s-1 (M-0.1), 0.15 s-1 (M-0.15), 0.2 s-1 (M-0.2) ve ek olarak 0.15 s-1(G-0.15) özgün çoğalma hızına sahip glukoz temelli üstel besleme stratejisiyle incelenmiştir. En yüksek hücre konsantrayonu M-0.15 koşulunda 32. saatte 9.6 kg m?3 olarak bulunurken, en yüksek rGI aktivitesi M-0.1 koşulunda 32. saatte A=16399 U L-1 olarak elde edilmiştir. Ayrıca, histidin-tag peptidine doğru afinite gösterebilecek petit lagand seçiminde faj display yöntemi kullanılmıştır. Peptit-peptit etkileşim özelliklerini belirlemek yüzey plazmon rezonans analizli gerçekleştirilmiştir.