DOÇ. DR. OĞUZ KUL

Sınır hastalığı virüsü ile doğal enfekte kuzu ve oğlak beyinlerinde apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmaların karşılıklı değerlendirilmesi Evaluation of apoptotic and anti-apoptotic mechanisms in sheep and goat brains naturally infected with border disease virus

Sınır Hastalığı (SH) Türkiye dahil, dünyada koyun ve keçi popülasyonlarında abortus veya persiste enfeksiyonlar nedeniyle ülke ekonomisinde ciddi kayıplara neden olan ve Pestivirüsler tarafından oluşturulan viral bir hastalıktır. Hücre kültüründeki sitopatojenitelerine göre Pestivirüsler, apoptotik hücre ölümünü tetikleyen sitopatik (SP) ve sitopatik olmayan (SPO) tür olarak ikiye ayrılırlar. Sitopatik olmayan türler enfekte ettiği hücrelerde apoptozisi engelleyici etki göstererek persiste enfeksiyondan sorumludur. Sınır Hastalığı Virüsü’nün (SHV) apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmalarının merkezi sinir sisteminde araştırıldığı sınırlı sayıda çalışma vardır. Bu çalışmada, SHV enfekte kuzu ve oğlaklarda; apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmaların karşılıklı araştırılması ve eğer varsa SHV’nin merkezi sinir sisteminde hangi yolakla apoptozisi tetiklediğinin ortaya konulması amaçlanmıştır. Bu amaçla da; SHV ile enfekte hayvanların beyin kökü ve orta beyin bölgesinde meydana gelen lezyonlarda; apoptotik (kaspaz 3, kaspaz 9) ve anti-apoptotik (Bcl-2) mekanizmalar, sitokin yanıtı (TNFR1, TNF-?, INF-?, eNOS ve iNOS), apoptotik hücre sayılarının tespiti (TUNEL), reaktif gliozis (GFAP), myelin hasarı (LFB) incelenerek sağlıklı kontrol dokuları ile karşılaştırılmıştır. Çalışmanın materyalini, moleküler ve immunoperoksidaz testlerle SH tanısı konulan 10 kuzu, 5 oğlak ve sağlıklı kontrol için ise sağlıklı 3 kuzu ve 3 oğlaktan alınan beyin dokuları oluşturmuştur. Parafine gömülen dokulardan alınan 5 ?m kalınlığındaki kesitler, hematoksilen-eozin ile boyandıktan sonra histopatolojik incelemede, nöron dejenerasyon ve nekrozu, gliozis, myelin kaybı, perivasküler hücre infiltrasyonu ve vaskülit bulguları dikkate alınarak lezyon şiddetine göre skorlandı. Bu çalışmada, SHV pozitif hayvanlardaki beyin kökü ve orta beyin bölgelerinden alınan kesitlerde; indirekt immunoperoksidaz testlerde tavşan-anti SHV poliklonal antikoru ve ticari firmalardan temin edilen apoptotik ve anti-apoptotik mekanizmaların tanımlanmasında rabbit poliklonal kaspaz 3, 9, Bcl-2, TNFR1, TNF-? ve INF- ?, TUNEL, GFAP, eNOS, iNOS antikorları ve myelin hasarı tespiti için histokimyasal boyama olarak da LFB kullanıldı. İmmunoperoksidaz test sonuçlarına göre; kaspaz 9, Bcl-2, TUNEL, GFAP, eNOS ve iNOS immunopozitif boyanma yüzde alanları, kontrol grubu hayvanlardakine oranla istatistiksel olarak önemli (p0.05). Deney grubu hayvanlarda, enfeksiyonun şiddetinde artışla birlikte myelin kaybı ve reaktif glia hücrelerinde GFAP varlığının arttığı görülmüştür. Sınır Hastalığı Virüsü ile enfekte çalışma grubu hayvanlar ile sağlıklı kontrol grubu hayvanların karşılaştırılması sonucunda; en çarpıcı bulgu beyinde eNOS ve iNOS varlığının hastalığın şiddeti ile doğru orantılı artmasıdır ve bunun SHV enfeksiyonunda şekillenen apoptozis belirteçleri ile uyumlu olduğu gösterilmiştir. Aynı zamanda, SHV ile enfekte hücreler arasında apoptozise giden hücrelerin baskın olarak içsel yolu seçtikleri ve içsel yol üzerine de en büyük etkinin önemli derecede artan NO seviyesi ile ilişkili olabileceği ortaya konulmuştur. Deney grubu hayvanlarda görülen myelin kaybı ile GFAP varlığı sonuçlarına göre; enfeksiyonun şiddeti arttıkça dejenerasyon derecesinin de paralel olarak arttığı görülmüştür.

Farelerde Toxoplasma Gondii ME49 suşu ile deneysel enfeksiyonda patolojik bulgular, kist lokalizasyonu ve kist büyüklüklerinin incelenmesi

Toksoplazmoz insan dahil memeli hayvanlar ile kanatlılarda Toxoplasma gondii tarafından oluşturulan, atık, ölü doğum ve ölümcül enfeksiyonlarla karakterize sistemik protozoer bir enfeksiyondur. Toxoplasma gondii doku kistleri, parazitin konak savunmasından kolaylıkla saklanabildikleri ve yavaş çoğalan dinlenme aşaması olarak bilinirler. Toksoplazmozun doku kistleri üzerine yapılan deneysel invivo çalışmalarda, etkenin ookistleri oral ya da intraperitoneal yolla verilerek enfeksiyon şekillendirilebilmektedir. Özellikle, bir molekül ya da ilacın doku kistine etkinliğinin araştırıldığı deneysel çalışmalarda, deney hayvanlarının beyinlerinde kist varlığı, yerleşimi, büyüklüğü ve sayısının önceden bilinmesi büyük önem taşımaktadır. Benzer şekilde değişik inokülasyon yollarında, beynin hangi bölgesinde daha çok doku kisti oluştuğu ya da herhangi bir patolojik anatomik bölge seçimi olup olmadığı konularının aydınlatılmasına ihtiyaç bulunmaktadır. Bu çalışmada, oral ve intraperitoneal yollarla T. gondii ME49 suşu verilerek, inokülasyon sonrası 30 ve 60 ıncı günlerde şekillenen doku kistlerinin; beyinde yerleşimi, büyüklükleri, sayılarının belirlenmesi ve beyinde şekillenen histopatolojik değişikiklerle birlikte değerlendirilmesi amaçlandı. Çalışmada 28 adet 2 aylık Swiss albino dişi fare kullanıldı. Her birinde 7 fare yer alacak şekilde 4 ayrı grup oluşturuldu. Grup 1 (n=7) ve Grup 2 (n=7) `ye oral yolla, Grup 3 (n=7) ve Grup 4 (n=7) `e ise intraperitoneal yolla 2×10² Toxoplasma gondii ME49 ookisti verildi. Etken inokülasyonundan 30 gün sonra Grup 1 ve Grup 3, 60 gün sonra ise Grup 2 ve Grup 4’deki farelere ötenazi yapılarak beyinleri çıkarıldı. Rutin doku takip yöntemleri ile işlenmek üzere; beyincik, beyin kökü, orta beyinden geçecek şekilde alınan parasagittal kesitler parafine gömülerek, 5 µm kalınlığındaki kesitler alındı ve hematoksilen eozin ile boyandı. Toxoplasma gondii doku kisti antijenine karşı hazırlanan poliklonal fare anti-T.gondii primer antikoru kullanılarak immunoperoksidaz teknikle muayene edildi. Histopatolojik incelemede beynin farklı bölgelerinde meydana gelen; meningitis, perivasküler hücre infiltrasyonu ve gliozis şiddeti skorlanarak karşılaştırıldı. Enfeksiyon sonrası meydana gelen yangısal reaksiyonun, intraperitoneal grup fare beyinlerinde, oral inokülasyon yapılanlara oranla nispeten daha şiddetli olduğu ve inokülasyon sonrası geçen zamanla birlikte yangı şiddetinin azaldığı tespit edildi. Doku kistlerinin dağılımı açısından, orta beyin bölümünün beyin kökü ve beyinciğe oranla daha yoğun doku kisti içerdiği izlendi. Doku kistlerinin etrafında çoğu zaman herhangi bir yangısal reaksiyona rastlanmazken bazı bölgelerde yoğun mikroglia ve astrosit kümeleri içeren fokal alanlara rastlandı. Lezyonlar başlıca sırasıyla; orta beyin, beyin kökü ve beyincikte azalan şiddette tespit edildi. Orta beyinde özellikle ammon boynuzu, perihipokampal bölge ve amigdaloid komplekste lezyonların yoğun bir şekilde meydana geldiği görüldü. Doku kistlerinin özellikle damarlar etrafında yoğunlaştığı ve orta beyin bölgesinde görülen doku kistlerinin birbiriyle temas edecek kadar yakın dizilerek gruplar oluşturduğu gözlendi. Oluşan doku kistlerinin çap ortalaması Grup 1 de 16,29 µm , grup 2 de 17,83 µm, grup 3 te 21,05 µm ve grup 4 te 23,47 µm bulunmuştur. Buna göre intraperitoneal inokülasyon yapılan gruplarda inokülasyon sonrası aynı günlerde oluşan doku kistlerinin, oral inokülasyon yapılan gruplara oranla daha büyük olduğu anlaşıldı. İmmunoperosidaz test sonuçlarına göre; etkilenen bölgelerde dejeneratif ve nekrotik nöron sitoplazmaları, mikroglia ve bazı astrosit sitoplazmalarında T. gondii doku kisti spesifik antijen pozitif reaksiyonlara rastlandı. Özellikle, gliozis alanlarında, noktasal ve granüler tarzda immunreaksiyonlar tespit edildi. Doku kistlerinin, hem bradizoit, hem de daha zayıf olmak üzere kist duvarı anti- Toxoplasma gondii antikoruna karşı immunreaksiyon gösterdi. Doku kistleri içerisindeki bradizoitler, her biri ayrı ayrı seçilebilecek çilek veya üzüm salkımı benzeri bir görüntü gösterirken, immunoreaktivitenin yoğun olduğu doku kistlerinde iç detay seçilemedi. Sonuç olarak; İntraperitoneal inokülasyon yapılan farelerde, oral inokülasyon yapılan farelere oranla gliozis, meningitis ve perivasküler hücre infiltrasyonunun daha şiddetli şekillendiği ve doku kistlerinin daha büyük olduğu görülmüştür. Beyincik, orta beyin ve beyin kökü gliozis açısından incelendiğinde; lezyonların beyincikte en hafif düzeyde seyrettiği görülmüştür. Yine bu üç anatomik bölge lezyonların şiddeti açısından değerlendirildiğinde en şiddetli lezyonların orta beyinde meydana geldiği dikkati çekmiştir. Ayrıca intraperitoneal inokülasyon yapılan farelerde 30. günde nekropsi yapılan farelerde şekillenen perivasküler hücre infiltrasyonunun 60. günde nekropsi yapılan farelere oranla daha şiddetli seyrettiği anlaşılmıştır. Bu çalışmayla birlikte, T. gondii ME 49 suşu ile fare beyinlerinde doku kisti modeli Türkiye’de ilk kez uygulanmıştır. Türkiye’de daha önceden gerçekleştirilen deneysel çalışmaların birçoğu, T. gondii Tip I suşları (RH, Ankara) ile akut ve ölümcül sonlanan deney hayvanı modellerine işaret etmektedir.

Keçi ve koyunlarda doğal Peste des petits ruminants virüs (PPRV) enfeksiyonunda epitel dokuda sitokin yanıtın immunohistokimyasal teknikle incelenmesi

Peste des Petits Ruminants (PPR), koyun ve keçilerde eroziv-ülseratif oral lezyonlar, interstisyel pnömoni ve diyare ile seyreden, yüksek mortalite ve morbidite oranıyla ekonomik olarak ciddi kayıplara neden olabilen akut veya subakut seyirli viral bir hastalıktır. Peste des petits ruminants virüs, lenfotropik ve epitelyotropik özellik gösterir, en şiddetli lezyonlar lenfoid ve epitelyal dokuların baskın olduğu organlarda şekillenir. Hastalıkta immün cevabın oluşmasında başlıca lenfoid, fagositik ve hemopoietik hücreler rol alırlar. Bu hücreler arasındaki etkileşim ve koordinasyon ile konak yanıtının idaresi, bir grup protein olan sitokinler tarafından gerçekleştirilir. Hastalığın ağız mukozası ve akciğer epitel dokularında şekillendirdiği lezyonlarda, sitokinlerin rolüne yönelik daha önceden gerçekleştirilmiş bir araştırmaya rastlanılmamıştır. Bu çalışmada, PPR ilişkili yanak, dil ve akciğerlerde şekillenen epitel lezyonlarında IL-4, IL-10, TNF-? ve IFN-? sitokin yanıtının immunohistokimyasal olarak incelenmesi ve lezyonsuz kontrol dokuları ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Çalışmanın materyalini, PPR tanısı konulan 11 koyun, 6 keçi ve sağlıklı 5 keçiden alınan yanak mukozası, dil ve akciğer dokuları oluşturdu. Parafine gömülen dokulardan alınan 5 µm kalınlığındaki kesitler, hematoksilen eozin, gram boyama ve immunoperoksidaz teknikle muayene edildi. Histopatolojik incelemede, ağız ve dil mukozası için; epitel hücrelerinde hidropik ve/veya vakuoler dejenerasyon, hiperkeratoz, sinsityal hücre formasyonu, epitelyal nekroz, psödomembran, intrasitoplazmik ve intranükleer inklüzyon cisimcikleri, epitelyal doku içinde yangısal hücre infiltrasyonu değerlendirildi. Akciğer dokusu için ise; bronş ve bronşiyol epitel hiperplazisi, peribronşiyal, peribronşiyolar lenfoid manto oluşumu, tip II alveol epitel hiperplazisi, alveol lümenlerinde sinsityal hücre oluşumu, interstisyel mononükleer hücre infiltrasyonu, inklüzyon cisimcikleri, sekonder bakteriyel pnömoni ve nekroz bulguları dikkate alınarak lezyonlar şiddetine göre skorlandı. İmmunoperoksidaz testlerde, PPR Tu00 suşu kullanılarak tavşanda immunizasyon ile elde edilen rabbit-anti PPRV poliklonal antikorları, sitokin yanıtın araştırılması için ise ticari firmalardan temin edilen rabbit anti-bovine IL-4, IL-10, TNF-? ve IFN-? antikorları kullanıldı. Histopatolojik lezyonların hafif şekillendiği ve PPRV antijeninin immunohistokimyasal olarak gösterilemediği epitel dokularında sitokin yanıtın kontrol gruplarından farklı olmadığı dikkati çekti. Bu çalışmada, PPRV pozitif hayvanlardaki akciğer, dil ve yanak mukozasında IFN-? ve TNF-alfa immunopozitif boyanma yüzde alanlar, kontrol grubu hayvanlardakine oranla istatistiksel önemlilik (p0.05). Sinsityal hücreler ve alveolar makrofajlarda IFN-? ve TNF-? ekspresyonu bu çalışmayla ilk defa gösterildi. Sonuç olarak, PPRV ile enfekte dil, yanak mukozası epiteli ve akciğer dokusunda IFN-? ve TNF-? gibi proinflamatuar sitokin yanıtın belirgin düzeyde olduğu, PPR ile etkilenmiş epitel dokunun yangı hücrelerine ilave olarak sitokin yanıtta rol alabileceği gösterilmiştir. Anahtar Kelimeler: Epitel, IFN-gamma, IL-4, IL-10, immunohistokimya, keçi, koyun, küçük ruminant vebası, Peste des Petits Ruminants, PPR, sitokin, TNF-alpha