DOÇ. DR. MUSTAFA ARK

Normal ve preeklamptik plasentalarda ezrin/ radiksin /moesin (ERM) ekspresyonlarının incelenmesi

Preeklampsi, maternal ve fetal morbidite ve mortalitenin en önemli nedenlerinden biridir. Bu konuda çok fazla araştırma yapılmasına rağmen hastalığın etiyolojisi belirlenememiştir. Plasental bozuklukların hastalığın gelişmesinde önemli rol oynadığı kabul edilmektedir. Plasental sinsitiyotrofoblast hücrelerin mikrovilluslarının dökülmesi maternal endotel hücre hasarlarıyla sonuçlanır ve bu durum da hipertansiyon ve proteinüriye neden olur. Mikrovillus dökülmesi, hipoksinin başlattığı plasental apoptozisden kaynaklanmaktadır. Bununla beraber mikrovillus dökülmesinin mekanizması tam olarak anlaşılamamıştır. Ezrin-Radiksin-Moesinin üçü de yapısal olarak aktin-membran çapraz bağlayıcı proteinlerle ilişkilidir. Bu proteinlerin önemli görevlerinden biri de mikrovillus üretimine aracılık etmesidir. ERM proteinlerinin ekspresyon ve fonksiyonlarındaki herhangi bir bozukluk, preeklampside mikrovillus dökülmesinin görülmesine neden olabilir. Bu nedenle çalışmamızda bu hipotez sınanmıştır. İmmünohistokimyasal yöntem kullanılarak ERM proteinlerinin plasental lokalizasyonları değerlendirilmiştir. İmmünohistokimyasal çalışmalar, ezrinin plasentanın membranlarında özellikle de sinsitiyotrofoblast hücrelerinde lokalize olduğunu göstermektedir. İmmünoblotlama yöntemi ile ERM proteinlerinin ekspresyon ve aktivasyonları belirlenmiştir. Sonuçlarımız preeklampside ERM protein ekspresyonlarının total homojenatlar ve sitozolik fraksiyonlarda önemli derecede azaldığını göstermektedir. Diğer taraftan, preeklampside mikrovillus membran fraksiyonlarında moesin belirlenememesine rağmen ezrin ve radiksin seviyeleri değişmemiştir. Bunlara ek olarak preeklamptik plasentalarda ERM aktivasyonuda azalmıştır. Bütün bu bulgular bir arada değerlendirildiğinde, sonuçlarımız ERM proteinlerinin ekspresyon ve aktivasyonlarındaki azalmanın, preeklampside görülen mikrovillus dökülmesine katkısının olabileceğini düşündürmektedir. Eğer ilaç tedavisiyle, azalmış ERM ekspresyon ve aktivasyonları düzeltilebilirse preeklampsi semptomlarının önlenmesi olasıdır. Anahtar kelimeler: preeklampsi, ERM, plasenta

İnsan umbilikal ven endotel hücrelerinde uvabain ile indüklenen aponekrotik ölümlerde Rho Kinazın olası rolünün incelenmesi

Uvabainin indüklediği hücre ölümleri ve apoptoziste Rho kinazın olası rölü insan umbilikal ven endotel hücrelerinde (HUVEC) araştırılmıştır. HUVEC doğumdan sonra alınan umbilikal kordlardan izole edilmiş ve yalnızca primer hücreler deneylerde kullanılmıştır. Endotel hücreleri yapıştıkları yüzeyi tamamen kaplayınca, hücrelere uvabainin (0.1-10µM, 16 saat) farklı konsantrasyonları ile ROCK inhibitörü olan Y27632 (10µM) uygulanmıştır. Hücre morfolojisi ve yapıştıkları yüzeyden kalkmaları faz kontrast ve floresan mikroskobi ile, ROCK I ve kaspaz 3 ekspresyonları immünoblotlama ile ölçülmüştür. Uvabainin, hücre kopmasına ve membran tomurcuk oluşumuna neden olduğu bulunmuştur. Ayrıca 10µM uvabain uygulaması endotel hücrelerin tomurcuklu hücre sayısını anlamlı olarak artırmıştır. Y27632 ön uygulaması ise uvabainin indüklediği membran tomurcuk oluşumunu anlamlı olarak inhibe etmiştir. Uvabain yüzen ölü hücre sayısını da anlamlı olarak artırmıştır. Fakat Y27632 ön uygulaması yüzen hücre sayısında anlamlı bir değişikliğe neden olmamıştır. HUVEC’te uvabainin hücre kopmasına etkisi doz bağımlıdır. Bu etki Y27632 ön uygulaması ile geri çevrilmiştir. ROCK I ve kaspaz 3’ün aktif fragmantasyonu da 10µM uvabain uygulanmış hücrelerde anlamlı olarak artmıştır. Sonuçlarımız uvabainin indüklediği hücre kopması ve membran tomurcuk oluşumunda Rho kinazın önemli bir rolü olduğunu göstermiştir. Bu bulgular endojen uvabain düzeylerinin yükseldiği esansiyel hipertansiyon olgularında önemli olabilir. Ayrıca bulgularımız kanser hastalarında, uvabain ve ROCK inhibitörleri ile kombine tedavi olasılığını ima etmektedir. Anahtar Kelimeler : uvabain, Rho kinaz, apoptozis, HUVEC

Uvabain aracılıklı hücresel cevaplarda rho-kinaz enziminin olası rolünün proteomik yöntemlerle incelenmesi

Bir integral membran proteini olan Na+/K+-ATPaz, hücrelerdeki iyonik dengenin sağlanmasında rol oynamaktadır. Kardiyak glikozitlerden uvabain ise, bu iyon pompasının spesifik inhibitörüdür. Hücreler uzun süre uvabaine maruz bırakıldıklarında apoptotik hücre ölümleri gözlemlenmiştir. Ama bu mekanizmanın nasıl olduğu tam olarak aydınlatılamamıştır. Rho-kinazlar (rho-kinaz 1 ve rho-kinaz 2), küçük G proteinleri içerisinde en çok araştırılan efektörlerden biridir. Apoptozisdeki birçok biyokimyasal ve morfolojik olayda görev almaktadırlar. Bu çalışmada uvabain ile indüklenmiş apoptotik hücre ölümlerinde, rho-kinazın olası rolünü proteomik yaklaşımlar kullanarak değerlendirdik. İnsan umbilikal ven endotel hücreleri, spesifik rho-kinaz inhibitörü Y27632 varlığı veya yokluğu durumunda 16 saat süreyle uvabaine (10µM) maruz bırakılmıştır. Hücre homojenatları, 2-D jel elektroforezi ile ayrılmış ve coomassie blue ile boyanmıştır. Uvabain uygulaması sonucunda, 54 spotun değiştiği tespit edilmiştir. Uvabain + Y27632 uygulamasında değiştiği gözlenmiş olan 7 protein, MALDI-TOF MS yöntemi ile tanımlanmak üzere seçilmiştir. Caspase-7 ve protein-unc-119 homolog B proteinlerinin miktarları uvabain uygulaması ile artmış, Y27632 ön uygulaması ile azalmıştır. Buna ek olarak neurensin-2, C-type lectin domain family-2 member D ve putative FERM domain-containing protein FKSG-43 proteinleri uvabain uygulaması ile azalmış ve Y27632 uygulaması ile artmıştır. Bu sonuçlar, bu proteinlerin ekspresyonlarındaki değişiklikler üzerinde rho-kinaz yolağının önemini göstermektedir. Bununla birlikte sonuçlarımızın doğrulanması ve bu proteinlerin öneminin belirlenmesi için daha başka çalışmalara ihtiyaç vardır.