DOÇ. DR. EMİN ÖZKÖSE

Laktik asit bakterilerinde düşük pH ile uyarılabilen promotor: rcfB Low pH inducible promotor: rcfB in lactic acid bacteria

Bu çalışmada, Lactococcus lactis subsp. lactis IL1403 bakterisinde bulunan katabolit aktivatör protein (CRP) benzeri RcfB proteinini kodlayan rcfB geninin promotor bölgesinin karakterizasyonu yapılmıştır. IL1403 suşunun kromozomal DNA’sında bulunan rcfB geninin promotor bölgesinin çoğaltılabilmesi için primerler tasarlanmıştır. rcfB promotor bölgesi polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile çoğaltılmış ve pCT vektöre klonlanmıştır. Oluşturulan rcfB içeren pBGML4 plazmiti E. coli DH5? hücresine transfer edilmiş ve X-gal ile amfisilin içeren LB besiyerine ekilmiştir. Elde edilen beyaz koloniler PCR ile teyit edilmiştir. rcfB genini içeren plazmit, koloni PZR ile kontrol edilmiş tek koloniden izole edilmiştir. İzole edilen ve rcfB genini içeren pBGML4 plazmiti HindIII ve BamHI enzimleri ile kesilerek promotor bölgesi yapışkan kesim uçlarını içerecek şekilde agoroz jelden izole edilmiştir. Laktik asit bakterilerinde çalışabilecek pAK80 plazmiti HindIII ve BamHI enzimleri kesilmiş ve jelden izole edilen parça pAK80 plazmitine aktarılmış, sonuçta rcfB promotoru içeren pAK80 plazmiti oluşturulmuştur ve pBGML5 olarak numaralandırılmıştır. Oluşturulan plazmit PCR ve kesme enzimi ile teyitinden sonra, pBGML5 plazmiti elektroporasyon ile IL1403 suşuna aktarılmıştır ve BGML115 suşu oluşturulmuştur. rcfB geninin ekspresiyon seviyesi yedi farklı karbonhidrat ve iki farklı pH ortamında araştırılmıştır. Deney sonuçları farklı karbonhidrat ve asit şartlarında farklı ekspresiyonun seviyesinin gerçekleştiğini göstermiştir sonuç olarak rcfB gen regülasyonu karbonhidrat kaynağı ve ortamın pH’sına bağlıdır. Anahtar kelimeler; IL1403 suşu, rcfB geni, CRP, uyarılabilen promotor

Rumen funguslarının izolasyonu ve bu funguslara ait enzim genleri üzerine moleküler çalışmalar

Biyoteknolojik uygulamalar açısından önemli olan rumen fungusları ruminantlara ait dışkı örneklerinden izole edilmiş, morfolojik olarak cins düzeyinde Neocallimastix spp., Caecomyces spp. ve Orpinomyces spp. olarak tanımlanmıştır. Bu izolatların genomik DNA’larından ksilanaz, likenaz (1,3-1,4- ? -glukanaz) ve selülaz (karboksimetilselülaz, endoglukanaz) genleri spesifik primerler kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonuyla taranmış, Neocallimastix sp. GMLF1’in ksilanaz ve selülaz kodlayan genleriyle Orpinomyces sp. GMLF18’in likenaz kodlayan geni çoğaltılmıştır. Genler pCT vektörüyle Escherichia coli’ye aktarılarak ekspresyonu sağlanmış ve genlerin moleküler karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Ksilanaz kodlayan gen (xyn1B) 992 bç uzunluğundadır ve glikozil hidrolaz 11 ailesine ait tek katalitik domain içermektedir. xyn1B, Lactococcus vektörü pIL253 yardımıyla Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363, Streptococcus thermophilus 8894 ve Streptococcus bovis ES1 suşlarında ifadesi sağlanmıştır. Likenaz kodlayan gen (lic18A) 707 bç uzunluğundadır ve glikozil hidrolaz 16 ailesine ait tek katalitik domain içermektedir. lic18A, pIL253 vektörüyle L. lactis ssp. cremoris ve S. thermophilus’e aktarılarak ifadesi sağlanmıştır. Selülaz kodlayan gen (cel1A), 1367 bç uzunluğundadır ve glikozil hidrolaz 5 ailesine ait tek katalitik domain ile iki dockerin domain içermektedir. cel1A’da pIL253 vektörüyle laktik asit bakterilerine aktarılmış ancak bu gen laktik asit bakterilerinde çalışmamıştır. Xyn1B, Lic18A ve Cel1A enzimlerinin çalıştığı optimum pH, sıcaklık, inkübasyon süreleriyle enzimlerin termal stabilitesi belirlenmiştir. E. coli’de hücresel aktivite yüksek bulunurken laktik asit bakterilerinde enzimler hücre dışına salgılanmıştır. Neocallimastix sp. GMLF1’in ksilanaz ve selülaz üretimi, Orpinomyces sp. GMLF18’in ise likenaz üretimleri araştırılmış, bu enzimlerin çalıştığı optimum pH ve sıcaklıkları belirlenerek klonlanan genlerle karşılaştırılmıştır. Son olarak Neocallimastix sp. GMLF1, GMLF11 ve Caecomyces sp. GMLF12’nin linoleik asite toleransları incelenmiş ve Caecomyces sp. GMLF12’nin linoleat izomeraz enzim aktivitesi araştırılmıştır.

Laktik asit bakterilerinde bazı biyojen amin üretim potansiyellerinin moleküler olarak belirlenmesi

Bu çalışmanın amacı, doğal köy yoğurtlardan izole edilmiş olan 118 Streptococcus thermophilus ve 32′ si Lactobacillus bulgaricus’un biyojen amin üretme potansiyellerinin moleküler olarak belirlenmesidir. Toplam 150 izolatta histamin (hdc), tiramin (tdc), pütresin (odc) ve kadaverin (ldc) olmak üzere dört farklı geni polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) ile belirlenmiştir. 25 adet S. thermophilus izolatın histamin, 16 adet S. thermophilus ve 1 adet L. bulgaricus izolatın tiramin, 3 adet S. thermophilus izolatın izolatın pütresin ve 2 adet S. thermophilus izolatın izolatın kadaverin üretme potansiyeli PCR ile belirlenmiştir.