DOÇ. DR. ASHABİL AYGAN

Beta-1,4-endoksilanaz ve beta-(1,3-1,4)-glukanaz enzimlerini üreten Bacillus sp. izolasyonu, enzimlerin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu

Kahramanmaraş’ın Ahır Dağı eteklerinden alınan toprak örneklerinden izole edilen toplam 186 bakteri suşu içerisinde 8 suşun (% 4.30) ksilanaz enzimi 15 suşun (% 8.06) ise likenaz enzimi ürettiği belirlenmiştir. En yüksek ksilanolitik ve likenolitik aktivite gösteren H-12 suşu enzim üretimi ve karakterizasyon çalışmaları için seçilmiştir. Bazı biyokimyasal ve mikroskobik testlere tabi tutulan bu suş Bacillus sp. olarak tanımlanmıştır. Bacillus sp. H-12 suşu en yüksek ksilanolitik ve likenolitik aktivitesini pH: 7.0′ de ve 37 °C’de oluşturmuştur. H-12 ksilanaz ve likenaz enzimleri optimum aktivitelerini 50 °C’de ve sırasıyla pH: 6.5 ve 7.5’te göstermiştir. H-12 ksilanaz enzimi pH: 5.0-6.0 arasında 15 dakika % 81 oranındaki enzim aktivitesiyle stabil kalmaktadır ve H-12 likenaz enzimi aynı sürede pH: 4.0-8.0 arasında ortalama % 99 oranında enzim aktivitesi ile stabilitesini korumuştur. Ksilanaz ve likenaz enzimlerinin en yüksek stabiliteleri sırasıyla 40 °C’de 15 dakika ve 50 °C’de 20 dakikadır. Ayrıca her iki enzim de 15 dakika ön inkübasyonda 2 M NaCl varlığında en yüksek aktiviteyi göstermişlerdir. Her iki enzimin de enzimatik aktivitesi HgCl2 varlığında tamamen durmuştur (% 0). MnCl2 varlığında ise ksilanaz ve likenaz enzimleri sırasıyla % 148 ve % 155 oranında en yüksek rölatif aktivite göstermiştir. H-12 ksilanaz enziminin enzim aktivitesi 155.6 U/mL olarak hesaplanırken likenaz enzimininki 90.23 U/mL olarak hesaplanmıştır. Diğer yandan ksilanaz enziminin spesifik aktivitesi (778 U/mg) likenaz enzimininkinden (451.15 U/mg) daha yüksektir. SDS-PAGE analizi ile ksilanaz ve likenaz enzimlerinin moleküler büyüklükleri sırasıyla 29 kDa ve 98.94 kDa olarak bulunmuştur. İnce tabaka kromotografisi sonuçlarına göre ksilanaz enziminin son ürünleri ksiloz ve ksilooligosakkaritler iken likenaz enziminin son ürünleri glikoz ve daha uzun zincirli diğer oligosakkaritler olmuştur. Bu çalışmalar göstermektedir ki Bacillus sp. H-12 suşu tarafından üretilen enzimler yukarıda belirtildiği gibi faydalı özellikler taşımaktadır. Bu yüzden bu enzimler hayvan yemi, atık uygulamaları, kağıt ve kağıt hamuru ve biyoyakıt üretimi endüstrilerinde kullanılabilir.

Toprak bakterilerinden selülaz-free ksilanaz enziminin üretimi, izolasyonu, kısmi karakterizasyonu ve enzimin endüstriyel uygulamalarda kullanılabilirliğinin araştırılması Production, isolation, and partial characterization of the cellulase free xylanase enzyme from soil bacteria and determination of usage possibilities in industrial applications

Van gölünün kıyı sahillerinden alınan toprak örneklerinden Bacillus sp. izole edilen toplam 243 bakteri suşu içerisinde 50 suşun (% 22.6) selülaz free ksilanaz enzimi ürettiği belirlenmiştir. En yüksek ksilanolitik aktivite gösteren ASX42 suşu enzim üretimi ve karakterizasyon çalışmaları için seçilmiştir. Bazı biyokimyasal ve mikroskobik testlere tabi tutulan bu suş Bacillus sp. olarak tanımlanmıştır. Bacillus sp. ASX42 suşu en yüksek ksilanolitik aktivitesini pH: 9.0′ de ve 30 °C’de oluşturmuştur. ASX42 selülaz free ksilanaz enziminin optimum aktivitelerini 60 °C’de ve pH: 9.0’da göstermiştir. Ayrıca izole edilen bu enzimin stabilite pH yelpalzesi çok geniş olup pH: 3.5-9.0 aralığında stabilitesini 15 dakida % 90 oranında 30 dakikada %71 oranında koruduğu tespit edilmiştir. Termal stabilitesi ise 4ºC -60ºC aralığında % 68.7, 65-95ºC aralığında ise ortalama % 60 aktivite göstermektedir. Bütün sıcaklık değerleri incelendiğinde ortalama % 64.9 aktivite elde edilmiştir. İzole selülaz free ksilanaz enzimi bu özellikleri ile çok geniş bir sıcaklık aralığında yaklaşık % 65 düzeyinde aktiviteye sahiptir (Şekil 4.18).Ayrıca 60oC ‘de 15-30-45 dk ön inkübasyonda enzimi denatürasyona karşı en iyi koruyan ajanın % 20 (v/v) gliserol olduğu tespit edilmiştir. Metal iyonlarının enzim üzerine etkisine bakıldığında ise hem 5mM hemde10mM konsantrasyonlarda HgCl2 enzim için inhibitördür. Ayrıca kobalt (Co) ksilanaz enziminin enzim aktivitesini % 132’e, mangan (Mn) enzim enzim aktivitesini % 130 çıkararak oldukça stimüle etkisi göstermiştir. İyonik deterjanlar (SDS) enzimler üzerinde inhibitör etkisinde olmasına rağmen iyonik olmayan deterjanlar (Triton X-114) ksilanaz enzimine aynı etkiyi yapmamıştır. Diğer yandan EDTA (% 77), 1,10-Phenanthrolin monohidrat(%89), β-merkaptoetanol(% 92)inhibe edici etkide bulunduğu tespit edilmiştir. PMSF ise % 111 enzim için de aktivatör etkisi göstermiştir. Ksilan konsantrasyonunun enzim üzerine etkisine bakıldığında ise maksimum enzim aktivitesine % 1.0’lik ksilan konsantrasyonunda ulaştığı tespit edilmiştir. Enzimin substratlarına karşı spesifitesi incelendiğinde enzimin selülozu parçalayamadığı ve ksilan üzerine çok etkili olduğu bu sonuçlara dayanarak enzimin selülaz free ksilanaz olduğunu göstermiştir. SDS-PAGE analizi ile ksilanaz enziminin moleküler büyüklükleri sırasıyla 66 kDa olarak bulunmuştur. İnce tabaka kromotografisi sonuçlarına göre ksilanaz enziminin son ürünleri ksiloz ve ksilooligosakkaritler olmuştur. Enzim üretimi üzerine çeşitli faktörlerin etkisine bakıldığında ise en uygun inokülüm hacminin %10 olduğu, enzim üretimi için kullanılan ticari karbon kaynaklarından inhibe etkisinin en yüksek glikoz (%35) olduğu tespit edilmiştir. Organik karbon kaynaklarının hepsi stimüle edici etkide bulunmuş olup stimüle etkisi en yüksek karbon kaynağı olarak buğday samanı (%79) tespit edilmiştir. Enzim üretimi için kullanılan inorganik azot kaynakları ve Organik azot kaynakları test edilmiştir. Enzim üretimi için kullanılan metal iyonlarından Mn (%369) olan üstü bir sitümüle etki göstermiş iken Zn+2, Hg+2 çok yüksek inhibe edici etkide bulunmuştur. Enzim üretiminde kullanılan subsratlardan buğday samanının enzim üretiminde mükemmel bir subsrat kaynağı olduğu tespit edilmiş olup enzim üretiminde en yüksek verimin alındığı subsrat konsantrasyonu ise %1 olarak tespit edilmiştir. Bu çalışmalar göstermektedir ki Bacillus sp. ASX42 suşu tarafından üretilen enzimler yukarıda belirtildiği gibi faydalı özellikler taşımaktadır. Bu enzim hayvan yemi, atık uygulamaları, kağıt ve kağıt hamuru ve biyoyakıt üretimi, deterjan, gıda ve fırıncılık, peyzaj ve fidancılık, kimya endüstrilerde kullanılabilme potansiyeline sahiptir. Özellikle tohum kabuk kalınlığından kaynaklı çimlenme problemi yaşayan bitkilerin çimlendirilmesinde çok faydalı olduğu ve bu alanda kullanıla bileceği kanısı oluşmuştur.